N糖基化治療性抗體—結構、表征方法和治療潛力的研究

　　自20世紀80年代以來，單克隆抗體作為治療性藥物得到快速的發展。與小分子藥物相比，單克隆抗體的優勢在于具有較高的靶向特異性、毒副作用小和半衰期長的優勢。而不足之處包含復雜的生產、純化過程，以及翻譯后修飾（PTM）導致單克隆抗體結構和功能的異質性。

　　在這些翻譯后修飾的情況中，Fc區域的糖基化是導致功能異質性的關鍵，Fc區第297位天冬氨酸(Asn)上有兩個保守的N-糖基化位點，其在抗體的效應功能中起重要作用，包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）、補體依賴的細胞毒作用（CDC），抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）。此外，有研究結果顯示Fc區部分唾液酸化可以使抗體獲得抗炎作用。為了更好的利用N-糖基化治療性抗體的優勢，本篇文章作者主要對對Fc區N-糖基化聚糖的結構、表征方法和治療能力進行詳細介紹。

　　1.N-聚糖的形成

　　在真核生物中，N-聚糖的形成首先通過寡糖基轉移酶復合體識別天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸（NXS/T）序列基序，其中X可以是除了脯氨酸以外的任意氨基酸，然后經過翻譯后修飾連接到內質網中蛋白質的天冬氨酸殘基上。IgG型抗體NXS/T序列基序位于重鏈的CH2結構域中（圖1），表1給出了目前（哺乳動物）細胞培養產生的抗體中產生的最普遍的聚糖結構。

　　2.形成不同N-聚糖治療性抗體的因素

　　（1）細胞系：目前中國倉鼠卵巢（CHO）是用來表達治療性抗體最廣泛的細胞系，研究發現不同的細胞系會導致治療性抗體的糖基化譜發生改變。例如小鼠細胞兩種不同的細胞系SP2/0和NSO，在Fc區會產生兩種不同的糖基化聚糖，分別是α,1,3半乳糖糖基化和N-羥乙酰神經氨酸（NGNA）；

　　（2）發酵過程也會影響糖基化譜：例如溶解氧濃度、pH、二氧化碳、溫度和生產模式等；

　　（3）糖基化工程：通過操縱宿主合成途徑，例如基于酶化學法的糖基化工程可以用來開發均一糖型的治療性抗體；還可以通過基因工程的方法，例如敲除巖藻糖轉移酶8、過表達半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶等；另外，酵母不能合成GDP-巖藻糖，可用酵母作為表達系統，生產不含巖藻糖糖型的抗體。

　　3.表征N-聚糖治療性抗體的方法

　　N-聚糖結構具有多樣性，其構成異構體的數量、觸角形式和亞基之間不同的連接方式都增加了分離和檢測的難度。目前基于分離和質譜技術表征N-聚糖治療性抗體的方法包括（圖2）：

　　（1）電噴霧電離質譜（ESI-MS）：ESI-MS已成為解決與碳水化合物有關的結構問題的有力工具。ESI-MS在鑒定各種甲基衍生物的碎片、確定各種單糖殘基的連接位置非常有用；

　　（2）酶促（PNGaseF）或化學釋放：N-聚糖可以通過N-糖苷酶（PNGase F）或其他烯醇糖苷酶水解從治療性抗體中解離出來，然后引入熒光基團，例如2-AB、APTS和ANTS，熒光基團可以增強聚糖的色譜和電泳分離能力，提高檢測的靈敏度。若不引入熒光基團，可以使用陰離子HPLC分離聚糖，并用HPAEC-PAD檢測；

　　（3）蛋白水解聚糖并檢測糖肽：治療性抗體可以使用蛋白酶酶切抗體，然后使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）富集聚糖，分離后用質譜檢測糖肽。通過蛋白酶切的方式，對糖肽進行質譜分析，可以了解聚糖的位點特異性。

　　4. N-聚糖治療性抗體結構動力學研究

　　由于受發酵過程因素的影響，生產治療性抗體時會產生不同N-聚糖構型的治療性抗體，研究人員對N-聚糖治療性抗體混合物進行結構動力學研究。

　　（1）X射線晶體學：利用X射線來研究晶體中原子排列信息，再從中分析獲得原子的位置信息，即晶體結構。由于聚糖的靈活性和相關電子密度分散的因素，使用X射線不能完全分解聚糖，但晶體結構結果仍可以看出在CH2結構域內顯示出較大的構象異質性。

　　（2）分子動力學（MD）：研究人員利用分子動力學進一步了解聚糖和Fc區結合狀態。其結果顯示，聚糖中兩個支鏈α,1-6和α,1-3的靈活性不太相同，α,1-6支鏈在肽相互作用和非相互作用狀態之間相互交替，α,1-3只在非相互作用狀態中。此外，還證明了碳水化合物（聚糖）和蛋白質相互作用的減少，有利于CH2結構域中碳水化合物的相互作用，從而減少蛋白間相互作用，有利于穩定Fc區與Fcγ受體結合部位的構象。

　　（3）FTIR和Trp熒光光譜法：雖然熒光光譜法無法顯著檢測到顯著的三級結構，但在過去也被應用于分析聚糖依賴性結構。例如使用熒光光譜法分析具有高甘露糖組成的IgG和去糖基化的IgG，在熱解折疊期間高甘露糖IgG顯示出解折疊溫度降低的趨勢。

　　5.N-聚糖結構對抗體與Fc-受體結合的影響

　　如上所述，聚糖結構會影響Fc結構域的構成空間，從而影響Fc與受體的相互作用。許多研究已經進行了不同聚糖結構的IgG與Fc免疫受體相互作用的實驗，作者對其結果進行了概述，如表2所示，其中橙色表示降低抗體與受體的結合能力，綠色表示提高抗體與受體的結合能力，灰色表示為發生改變。

　　（1）非/去糖基化結構導致大多數IgG無法結合受體，和FcγRIa結合減少；

　　（2）含有巖藻糖糖基化的抗體對C1q和FcγRIa的結合沒有影響，而去巖藻糖基化的抗體對FcγRIIIa和FcγRIIIb受體的結合能力顯著增強；

　　（3）去半乳糖基化（G0）的抗體降低了對C1q和所有FcγR受體的結合傾向。部分半乳糖基化的抗體導致與C1q的結合增加，在完全半乳糖基化后，除了FcγRIa受體，抗體與FcγRs受體的結合均顯示小幅度的增加。

　　（4）不同唾液酸化的聚糖結構顯示出與FcγR的不同的結合能力（增高/降低）。

　　6.評估N-聚糖結構影響抗體與Fc-受體結合的方法

　　用于分析IgG與不同Fc受體之間相互作用的方法可以概括為三種（表3）：

　　（1）基于細胞殺傷的測定方法：基于ADCC、ADCP和CDC的原理，使用PBMC作為效應細胞，加入抗體后檢測靶細胞的裂解、凋亡等情況，其結果能反應抗體的生物效應，這也是體外檢測（IgG）Fc介導細胞功能的代表方法。

　　（2）基于細胞結合的測定方法：通過檢測效應細胞的活化情況、檢測細胞因子的釋放代替檢測殺傷或吞噬靶細胞的情況，這種方法有益于提高檢測的穩定性和重現性，例如流式細胞分析儀（FACS）、ELISA等；

　　（3）不依賴于細胞結合實驗：無細胞結合實驗只關注IgG與不同Fc受體的相互作用，僅需要小劑量就能進行檢測，減小其他成分對輸出信號因子的影響，最常見的方法有：表面等離子共振（SPR）、熒光能量共振轉移（FRET）等。

　　如圖3所示，雖然不依賴于細胞結合實驗的檢測方法技術可行性高、具有靈敏度，但不能反應體內的真實作用情況。所以，研究中應將高靈敏度的不依賴于細胞結合實驗檢測技術與相關的體外細胞檢測技術相結合，如果條件允許，還可以使用體內數據來表示潛在的生物學相關的結合行為的差異，使研究結果更具說服力。

　　總結：聚糖結構對抗體的治療潛力方面有著重要的影響，通過表征聚糖的結構，分析單一聚糖治療性抗體的功能和治療潛力，可以針對性地對治療性抗體進行改造，提高N-聚糖治療性抗體的臨床效果。

　　參考文獻：Florian Cymer, Hermann Beck. et al. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation – Structure, function andtherapeutic potential. Biologicals (2017), 1045-1056