PCR基本原理與過程

變性-退火-延伸（圖1）。

PCR中DNA的合成過程均以兩個引物特異性結合處為起點。

引物 通常是分別取自靶DNA序列兩條鏈的3’端相向的長度在16~25nt的單鏈DNA片段，即引物頭是5’，尾是3’。引物自身為靶DNA一端的互補序列，最終成為產物的組成部分。

耐熱的DNA聚合酶 。在已發現的耐熱DNA聚合酶中， Taq pol的活性最高，達200000U/mg，反應的最適溫度為75-80℃，此時延伸速率達150-300個核苷酸/（秒·酶分子）。該酶具 5’->3’外切酶活性 ，不具3’->5’外切酶活性，故其不具Klenow酶的校對功能，在擴增過程中引起堿基錯配概率大大增加，概率約1/300-1/18000，在經過25輪擴增后，擴增產物的序列中平均每400個堿基就有一個與原始序列不同。 Taq pol具有類似脫氧核糖核酸末端轉移酶的活性（非模板依賴的聚合活性），特別對dATP的聚合能力最高，利用這一特性，我們可以構建dT-載體克隆dA尾的產物。同樣，利用Klenow酶可以去除3’尾巴，生成平末端的產物。除 Taq pol，人們還陸續發現和獲得了其他幾種耐熱DNA聚合酶，如 Th DNA聚合酶、 Vent DNA聚合酶、 Sac DNA聚合酶以及修飾 Taq pol聚合酶等。

延伸溫度與時間 。盡管 Taq pol在75-80℃時活性最高，通常采用的延伸溫度為72℃，此時的堿基摻入率約35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。通常擴增1kb以內的DNA片段延伸1min即可，而當代增序列長達3-4kb時，則需延長3-4min；然而當擴增小于150bp的片段時則可以省略延伸步驟，因為在退火溫度下 Taq pol的活性已足以完成靶序列的合成。通常PCR最后一輪循環中可以適當將延長時間延長至4~10min，以使PCR反應完全提高擴增產量。在實際操作中，應注意前幾輪循環的延伸時間要足夠，以使靶序列延伸完全從而提高PCR反應的特異性。此外當待擴增DNA濃度較低時，由于堿基摻入率較低，可適當的延長反應延伸時間。

PCR終產物 分為復雜產物和長度特異產物兩部分（圖2）。 長度特異產物 是長度嚴格限定在兩個引物鏈的5’端之間，是特異的目標片段。 復雜產物片段 是以包含有目標序列的初始DNA片段為模板所合成的PCR產物，其5’端為引物序列，而其3’端則遠超出另一引物的結合區，以及以這樣的DNA鏈為模板，另一引物結合并延伸形成的一端為雙鏈特異產物部分，另一端為單鏈的復雜PCR產物。形成復雜產物片段的原因是：新合成的兩條DNA鏈5’端分別是兩引物的5’端，是固定不變的，而3’端則沒有固定的止點，長短不一（其止點與模板長度、PCR延伸設定時間有關）。長度特異性產物因擴增長度一致（反應到目的片段的最后一個堿基即停止），而呈指數倍性（2 n ）增加。復雜產物片段以算數倍數（2n）增加，且有多種長度類型，導致每個特定分子質量的復雜產物片段的拷貝數很少，相比長度特異性產物其在PCR總產物中幾乎可以忽略不計。這使得PCR的反應產物無需再純化，就能保證足夠的純度用于隨后的分析與檢驗。

PCR產物量 可用 P=N×(1+E) n 計算。P代表PCR產物的拷貝數，E代表平均每個熱循環的PCR擴增效率，N代表起始模板拷貝數，n代表熱循環次數。平均擴增效率理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。產物增長整體呈現“指數-線形-平臺”模式（圖3）。初期，因DNA聚合酶活力足、dNTP底物充足，模板濃度低而自身復性少，PCR擴增效率非常接近100%，產物呈現“指數”增長模式。隨反應進行，受DNA聚合酶活力下降等原因，PCR效率接近0，最終停止反應而進入平臺期。絕大多數情況下，經過 35 個循環，PCR擴增都將進入到平臺期。

[1] 王廷華, 劉佳, 夏慶杰. PCR理論與技術[M]. 第三版. 背景:科學出版社, 2013:1-22.