【實驗目的】
1．了解PCR-SSCP技術的原理。
2．了解并熟悉PCR-SSCP技術的步驟。
【實驗原理】
PCR-SSCP是1989年日本Orita等創建的篩查突變的新技術。它是一種簡單、快速、經濟的點突變篩查手段。PCR-SSCP技術的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動速率，相同長度的
DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產生立體構象的不同，造成泳動速率的不同，產生不同的泳動帶。PCR擴增后的DNA片段經變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質必須經過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
為了便于觀察分析結果，PCR擴增體系中常加入a-32P dNTP標記PCR產物，電泳后放射自顯影觀察泳動帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標記。
單鏈DNA片段的立體構象主要與堿基序列相關，但也受到其他條件的影響。因此，PCR-SSCP技術的關鍵在于電泳時的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內相互作用的其他溶質等。
PCR-SSCP的缺點是存在假陰性和假陽性，一般對長度不超過300bp的待測片段的檢出率為70~80%。
【實驗用品】
1．PCR擴增儀；聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置；電泳儀；電泳槽。
2．6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（49：1）、1′TBE、10%過硫酸銨、TEMED、甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液、瓊脂糖
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
4．PCR擴增相關試劑。
【實驗步驟】
1．PCR反應（同前）
PCR產物經瓊脂糖電泳確認。
2．PCR反應結束后，取5μl擴增產物加10μl甲酰胺上樣緩沖液混勻，98℃ 變性10分鐘，迅速冰浴。
3．非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
3.1 制備50ml 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加 TEMED 25μl、10%過硫酸銨250μl，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入1′TBE電泳緩沖液，緩沖液應高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。
3.2 取已變性的5μl PCR擴增產物加到點樣孔中，以200V/cm電泳 4~5小時。
3.3 拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個塑料盤內，用蒸餾水沖洗1~2遍。
3.4 倒入固定液，固定 8~10分鐘。
3.5 用蒸餾水沖洗1~2遍；倒入銀染液，銀染10~12分鐘。
3.6 用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現清晰的銀染帶。
3.7 用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀察PCR-SSCP結果。
【實驗結果分析】
觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上DNA單鏈帶，根據異常泳動變位篩查突變樣本。