PrimerPremier引物設計

Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司開發的專業用于PCR或測序引物以及雜交探針的設計，評估的軟件，和Plasmid Premier2.02一起是該公司推出的最新的軟件產品。其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（Genetank），引物設計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（Motif）。這里我們主要介紹其引物設計功能，其他功能的介紹請參看Plasmid Premier2.02。
打開程序首先進入的是序列編輯參看，與Plasmid Premier相比，其多了一個語音校正的功能，即在輸入序列的時候，程序自動將堿基讀出，以便用戶進行校正，保證輸入的正確和快速。
點擊該界面的按鈕即可進入到程序的引物設計窗口。
該界面共分為四層，最上面一層左面是5個控制按鈕，用于實現引物設計中的各種功能，包括引物自動尋找，尋找結果查看和引物編輯；右邊是觀察兩個引物在模板上結合位置的直觀圖以及對正鏈還是負鏈引物進行選擇；第二層是顯示模板和引物序列及二者間的配對情況的顯示；第三層是顯示兩個引物的各種參數，包括給引物的打分，引物以及產物的起始位置、長度、Tm值、GC％消光系數、簡并性；最后一層是給出的有關于引物的二聚體結構、發卡結構、錯配情況和引物間二聚體結構的預測，左邊是顯示是否存在以上各種對PCR擴增有影響的結構，右邊顯示的是這些結構的位置，結構細節和穩定能，利用這些參數可以對引物作出可靠的評價。
下面是根據模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設定所要搜索的引物的類型，包括PCR引物，測序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設定搜索引物的范圍，以及最終PCR產物的長度和引物的長度等。
并通過來點擊按鈕來設置一些搜尋參數：
這些參數包括引物的Tm值，GC比，有簡并性堿基，3’端穩定性，引物的穩定性，重復序列，二聚體/發卡結構和與模板及可能的雜質DNA（需要從另外的序列文件中讀入）之間的錯配情況，這些參數的設定可以根據要求變化，程序本身根據一定的標準分成從極高嚴謹性到極低嚴謹性5個檔次。該程序對引物的自動搜索過程是采用的排除法，根據用戶設定的引物范圍和產物長度所規定區域內，所有的符合設定的引物長度的寡核苷酸都被視為可能的引物，然后根據以上各個參數逐步去除不符合條件的寡核苷酸，經過這種層層剔除的篩選，最終找到符合用戶所設定標準的引物，如果找不到合適的引物可以逐步降低要求來進行進一步搜尋。
搜尋到引物結果最終顯示在下面的窗口中：
在結果窗口中給出了程序給該對引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長度以及產物的長度。通過直接點擊各對引物在相應引物搜尋界面中相應的顯示引物的各種信息。包括其各種參數和各種可能存在的不利結構。
其中用File菜單中的Parameter命令可以對系統參數，PCR反應條件和程序打分系統進行設置，以幫助用戶根據自己的特殊要求來進行引物設計，其中反應條件按照引物濃度，單價離子濃度，Mg離子濃度，Na鹽濃度等。而打分系統是參照的以下公式：
利用該打分系統可以為對引物進行有效評估和和在引物之間進行對比選擇提供有效的有效的依據。
最后還可以在利用引物編輯窗口對程序自動找到的或手工找到的引物序列進行編輯，以便用戶能在引物引入突變及加入特定的酶切位點，并對修改后的序列的二聚體結構、發卡結構和錯配進一步評估。其中是對修改后的引物再次搜尋找出其最合適的引發位置。
除了以上的直觀地對引物進行基本的設計和評估功能外，該程序還提供了多種數據報告，主要通過Report菜單和Graph菜單中命令來實現：

另外，Primer Premier在引物設計上一個比較獨到的功能，就是能輔助進行巢式PCR引物設計，在首先進行了引物自動搜索后，即可通過Function菜單中Multiplex/Nested Primer命令進入巢式PCR引物設計，通過點中代表各個引物的三角號來選擇引物，然后根據最下面的窗口中各個引物之間的二聚體形成情況來判斷引物是否適合于作為巢式PCR的引物。另外該菜單中的Database命令可以讓用戶建立自己的引物數據庫，方便于查找和對照。
整體而言，Primer Premier這個軟件在引物設計方面還是比較優秀的，能夠對全面的給出一個引物的各種參數，并在多個必需的方面對引物作出有效的評價，但是在程序設計中還有一些不足，例如在錯配情況中，只對是否存在錯配作出了預測，也給處理錯配的穩定性，但是錯配對PCR的影響還需要根據錯配是否發生在引物的3’來判斷，3’發生的錯配要比其他位置的錯配對引物的引發效率的影響大的多，所以在使用中應當結合著錯配的具體配對情況來綜合分析，這方面程序未能進行量化，只有通過用戶根據經驗判斷；另外，程序對于產物的Tm值和引物Tm值之間的差異也為能給出評價，如果二者差異較大（如>22℃），則容易造成退火時引物－模板和模板－模板退火之間的競爭。而在結果輸出方面，該程序也只能以圖文格式打印，無法轉換成文本格式。