1、反應體系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul
2、Primer 濃度，需要摸索，從200nM到700nm等，設置不同濃度。
3、每個引物濃度，從well 1到12設置4個樣本，陽性cDNA 1和2，NTC以及H2O，做triplicate。
4、若用ABI7000或7700，所有的PCR條件可設置成一致的，減少麻煩，當然，引物設計時就要考慮好，第一步除UNG，然后預變性，然后 PCR循環，ABI采用二步法，退火延伸均60度，循環最多40。
5、結果分析: 陽性1，2曲線，NTC的Ct值需大于陽性Ct值至少5到6個循環以上，H2O基本Ct值接近40。
6、做Dissociation Curve，若好的引物，可見單一峰，若見兩個峰，則他們的溫度差值需在2度以上。
7、AGAROSE凝膠電泳證實，目的基因的長度，是否單一條帶，有無雜帶，和第6步的結果對照，引物二聚體的量，基因組DNA有無擴增。
8、選擇合適的引物濃度。
9、必須考慮cDNA的含量，有時所檢測基因表達非常低。
一般按上述步驟，都能做出，問題通常在于: 你的cDNA質量，所用試劑的質量（建議用進口，既然走到這一步，就省不了了），引物設計是否合理（序列，Tm值接近50或60度等）。
10、即便能所用引物能獲得擴增，但是并不能證明就能使用，如果采用相對法比較，還要做efficiency
curve，此法假定的E值是2，也就是說你的標準曲線斜率需要達到-3.3左右，但是實際并不一定如此。若擴增效率和內參不同，那只有重新設計引物，或者采用標準曲線法。
REAL BORING PCR，看來還是需要做許多工作的。
實在不行，如果有MONEY，那就用TAQMAN，買ABI的KIT，那些公司都優化好的，基本可以直接使用，何況SYBR GREEN
I的特異性不如TAQMAN，而且如果摸了無數次都不能獲得良好的結果，那些花掉的MONEY還不如買現成的，即省錢省時省力，不過就是喪失了從不斷的失敗痛苦中尋找成功的喜悅了。