RNA光譜分析與定量

DEPC 無核酸酶的水

紫外分光光度計 石英比色杯

一、材料與設備

1）紫外分光光度計。

2) 石英比色杯。

3)DEPC

4) 無核酸酶的水。

二、操作方法

(一）準備分光光度計

用 0.1%DEPC 水浸泡比色皿至少 15 min。

2) 用水或無 UV 吸收的緩沖掖設置基線。

3) 用水或無 UV 吸收的緩沖液稀釋 RNA 樣品，并進行檢測

4) 記錄樣品在波長為 230nm、260nm 和 280nm 處的吸收值，并打印 200?300nm 的掃描曲線。

(二）分光光度掃描曲線的分析

在-些情況 1F 有必要通過掃描分析而了解污染程度，而不是僅僅測定 260nm 和 280mn 的吸收值。抽提后殘留的微量酚、硫氰酸胍的掃描圖有明顯的差別，A₂₆₀:A₂₈₀ 的值會有細微差別，m 仍屬于可接受的范圍，而 RNA 濃度會苻顯著的改變。

由此，當用分光光度法分析 RNA 比值和濃度時，不僅要考慮 280nm,260nm，230nm 的吸收值，而更要在 200?300nm 范圍內進行掃描，在抽提 RNA 過程中所用試劑的微量殘留物能夠影響并誤導測定結果, 繼而影響后續試驗

(三）RNA 定量

根裾 RNA 樣品在 260mn 處的光吸收值和樣品的稀釋倍數，紫外分光光度計可以直接測出樣品的濃度，也可以按下式汁算：RNA 濃度 (ug/ml)=（A₂₆₀X 稀釋倍數)/(0.024XL) 式中：A₂₆₀ 為 260mn 波長處光吸收值；L 為比色池厚度，一般為 1 cm 或 0.5 cm;0.024 為每毫升溶液內含 1ugRNA 的光吸收值。當比色池厚度為 lcm，樣品 A₂₆₀ 為 1 時，RNA 的濃度約為稀釋倍數 X40ug/ml。

1) 整個操作過裎中應戴手套，盡量減少外源性 RNase 活性的影響。

2) 通常建議用凝膠電泳而不用分光光度法分析 RNA。因為電泳不僅能顯示 RNA 的完整性，而且在多數情況下，能顯示 RNA 的種類，如原核細胞的 18S/23SrRNA 和真核細胞的 18S/28SRNA

3) 根據用 EB 對條帶的分析可以大致確定 RNA 的濃度。

4) 除此之外，還可以通過熒光染色和 Agilent2100 生物分析儀對 RNA 樣品進行定量和完整性的分析。一些熒光染料，如RiboGreen，與核酸結合后其熒光強度顯著增強, 濃度為 lng/ml 的 RNA 經 RiboGreen 染色后可用熒光分析儀檢測和定量。對 RNA 進行精確定量時，可先用已知濃度的樣品設置標準曲線，當使用兩種不同染料濃度時，用 RiboGreen 定最的線性范圍包括三個數量級 lng/ml?lug/ml)。并且，RiboGreen 分析方法對樣品中的非核酸物質相對不敏感，因此_濃度與吸光值具有線性關系。使用該方法時應注意以下幾點：首先，RiboGreen 不能區分 DNA 和 RNA，因此要用無 RNase 的 DNase 去除 DNA; 其次，RiboGreeii 能夠吸附在試管壁上, 要用非吸附的、無核酶的聚丙烯塑料管; 再次，為了避免 RiboGreeii 試劑被光降解，應避光保存試劑，并在制備后的幾小時內使用；最后，應避免反復凍融 RNA 標準品，以免引起 RNA 鏈的剪切從而降低與染料的結合能力。另外，在核酸濃度低時，反復凍融會使其吸附在管壁上

5)Agilent2100 生物分析儀結合毛細管電泳、熒光染色等技術，能夠對 RNA 進行定量和完整件分析□其最大的優勢在于對 RNA 完整性的分析，它能顯示 18S 和 2SS 核糖體 RNA 的峰值和比例；另外，它對 mRNA 和 aRNA （tantisenseRNA) 的完整性分析也很有特點，完整的 mRNA 和 aRNA 主要由 lkb?2kb 之間的條帶組成，如果出現較多的低分子質量條帶, 則意味 RNA 的完整性較差。