SPA夾心ELISA實驗檢測CIC

實驗概要

金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可與IC中IgG的Fc段結合。將待測血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上，再以酶標記的SPA與之反應，即可檢測樣本中有無IC。

主要試劑

1. 5%與2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；

2. 牛血清白蛋白（BSA）緩沖液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；

3. HRP-SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶（HRP）制成結合物，最適工作濃度以方陣法滴定；

4. 熱聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加熱20min制成。

實驗步驟

1. 用PBS稀釋SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反應板微孔，每孔0.1ml（對照孔不包被），置4℃過夜后洗滌3次備用；

2. 待測血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混勻，4℃過夜后1600r/min離心20min，棄上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA緩沖液0.2ml，混勻，置37℃水浴30min，搖動，使完全溶解；

3. 將已溶解的待測血清沉淀物加至上述包被孔和對照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H₂0₂）0.1ml，37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH₂SO₄1滴終止反應。置酶標儀492nm測各孔吸光值；

4. 標準曲線制備：取正常人血清0.2ml，加熱聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃過夜。同時做不加熱聚合人耽的正常血清對照，以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標本操作。用稀釋的BSA緩沖液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀釋成120、60、30、15、7.5ug/ml，與待測血清同法操作，制成工作標準曲線；

5. 結果判斷：從待測血清吸光度值查標準曲線，即可換算成相當于熱聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常對照X 2S，即大于28.4ug/ml為陽性。

注意事項

1. 熱聚合人IgC應分裝貯存于-20℃，不宜反復凍融，否則易解聚；

2. PEG的濃度影響CIC沉淀量，須嚴格配制。

方法評論