TA克隆常見問題分析及其解決方案
問 題 可能的原因 建 議
轉化后無
克隆菌產生 轉化過程有問題或感受態細胞失活 可通過轉化pUC18/19等未切割的可用于抗性篩選的質粒，檢測感受態細胞的轉化效率和轉化操作是否正確
插入對照DNA片段的陽性率低
10×快速連接緩沖
液稀釋不當 提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應體積加1μl T4 連接酶緩沖液
連接反應存在問題 連接緩沖液只有低的活性。10×快速連接緩沖液含有ATP，溫度波動ATP 易降解。使用一次性分裝的緩沖液，避免其反復凍化
通過凝膠比較連接的和未連接的DNA 片段并檢查分子量標準DNA 片段是否被連接成高分子量的片段，用大約20ng DNA 分子量標準（如Lambda DNA/Hind III 分子量標準）建立一個連接反應以檢測連接酶及緩沖液的活力
T 突出端丟失，引起載體平端連接，因而藍色菌落數高于白色菌落數 避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用無外源核酸酶的T4 連接酶
插入克隆片段與插入對照DNA相比，白色菌落的比例低。 如果使用的感受態細胞的轉化效率很高（ ≥1 × 109 cfu/μg DNA），則是連接反應存在問題 如果使用1×109 cfu/μg DNA 的感受態細胞，用試劑盒中的陽性對照進行連接實驗， 白色菌落的比例應為70－90％。如連接反應沒有優化或失敗，雖然轉化的總克隆菌數很高（≥1×109 cfu/μg DNA 感受態細胞可獲得高至300 個菌落），但白色菌落很少或沒有。參見以上“連接反應存在問題”中的建議對策
采用插入對照DNA片段，連接轉化時白色克隆菌數低于60％。 10×快速連接緩沖液稀釋不當 提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應體積加1μl T4 連接酶緩沖液
T 突出端丟失，引起載體平端連接，因而藍色菌落數高于白色菌落數。 避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用系統自己提供的T4 連接酶，這種連接酶外切酶活力最低
連接溫度太高 連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率
PCR 產物連接時白色菌落數很少或根本沒有。 10×快速連接緩沖液稀釋不當 提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應體積加1μl T4 連接酶緩沖液
連接孵育時間不夠長 連接過夜可得到理想結果
PCR 產物中含有抑制連接的成分，導致連接的失敗 將PCR 產物和連接反應對照混合，觀察是否存在抑制效應。如懷疑有抑制成分存在，應重新純化PCR 產物
PCR 產物沒有3’-A 突出端，不能連接。 并非所有DNA 聚合酶都產生3’-A 突出端，如Pfu酶的PCR產物為平端。平端PCR產物可先通過聚合酶及dATP 進行加尾反應產生3’-A 突出端，再與T載體連接
由于紫外燈過度照射形成嘧啶二聚體，PCR 產物不能連接。
PCR 產物已經插入，但未破壞lacZ 基因的翻譯框。
插入片段：載體連接比例不理想。
連接的PCR 片段中可能有引物二聚體
PCR 反應擴增的多種產物克隆到pGM-T Easy或pBS-T載體中。
DNA 重排 檢測大量克隆觀察重排是否是隨機的。如果是隨機重排，通過篩選可得到有目的DNA 片段的克隆菌，而如果所有克隆是一種重排方式，則需要使用修補缺陷的菌株保護插入片段，減少重排事件的發生
PCR 連接反應只產生白色克隆（沒有藍色克隆） 氨芐失活，因而氨芐敏感菌可生長。 檢查氨芐平板是正常制備并在一個月內使用
菌株（如TOP10）喪失F’因子 檢測背景對照，如果菌落不是藍色的，則可能是宿主菌細胞丟失F’因子（假設acIqZ.M15 位于宿主菌的F’因子上，并使用正常平板）。用于T-載體系統的感受態細胞一定要正確制備
平板不適合藍白斑篩選。 檢測背景對照，如果克隆菌不是藍色的，檢查平板是否含有氨芐/IPTG/X-Gal 以及是否新鮮。如平板有問題，重新制備新鮮平板
含有目的PCR產物的克隆菌數不夠。 PCR 片段很多沒有A 尾。 將PCR 產物純化后進行加尾反應。樣品純化后進行連接反應
插入片段：載體比例不理想。 凝膠電泳檢測PCR 產物的完整性及產量，優化插入片段
多個PCR 產物被克隆進pGM-T 或pBS-T 載體 凝膠純化目的PCR 產物