由于一種細菌可同時產生多種β內酰胺酶，因此為了避免多種β內酰胺酶的相互干擾，我們應用肉湯稀釋法對產超廣譜β內酰胺酶（ ESBLs ）的 4 株肺炎克雷伯菌（ Kpn ）的 TEM 型編碼基因進行了原核表達。
一、 材料和方法
1． 菌株來源和表型鑒定： 4 株臨床菌株 No95 、 No96 、 No102 、 No106 為浙江省臺州第一醫院內科患者痰標本分離的 Kpn 。經抑制劑增強的肉湯稀釋法證實為陽性。
2． 細菌質粒 DNA 提取與 PCR 擴增：采用堿裂解法提取質粒 DNA 。根據 TEM-1D 編碼基因序列設計的 TEM 引物序列為 5' -TTAGACGTCAGGTGGCACTT -3' （ 76 ～ 95 ）和 5' -GGACCGGAGTTACCAATGCT -3' （ 1065 ～ 1084 ），由上海生物工程公司合成。 PCR 反應參數同前。設大腸埃希菌？（ Eco ） ATCC25922 、標準產酶 Eco （ TEM-26 ）作對照。
3． PCR 產物的純化、克隆：按照 PCR 產物純化 kit （ QIAgen ）的要求，純化目的片斷，取 3μl 與 pGEM-Teasy Vector(Promega) 連接。連接反應液轉化至 EcoDH 5a 感受態細胞，經含氨芐西林（ Amp50μg/ml ）的麥康凱培養基篩選。挑取白色菌落，接種于含 Amp 的 LB 培養液中， 37 ℃ 培養過夜。經 EcoRI （ Takara ）酶切鑒定。
4． 核苷酸序列測定及分析：以重組菌雙鏈質粒為模板，按 Sanger 雙脫氧末端終止法，于 Pharmacia 公司 ALF 自動測序儀進行雙鏈測序，結果在 GenBank 網上查詢。
5． 接合試驗：按照 Jacoby 等的方法進行，其中 EcoC600 （ Str r ，即鏈霉素抗性）為質粒接和試驗的受體菌。
6． 原核表達：分別加入 pET -28c 3 μl 、目的 DNA 3 μl 、 2 × Buffer5μl 和 T4 連接酶 2μl 于 0.5ml 的 Eppendorf 管中， 37 ℃ ，過夜。上述連接產物轉化于 EcoDH 5a 感受態細胞中，用的含卡那霉素 40μg/ml 的麥康凱培養基平板進行篩選。
7． 表達鑒定：挑取白色菌落置于含 Amp 的 LB （ 50μg/ml ）液中， 37 ℃ 振蕩過夜培養。堿裂解法提取質粒，并用 PCR 進行表達鑒定。
8． 表型鑒定：用 ESBLs 濃度梯度法進行表型鑒定。
9． 等電點（ pI ）測定：超聲破碎獲得酶的粗提液。按照 PhastSystem 電泳儀說明書和 Pharmacia Biotech 凝膠要求進行，電泳后，用頭孢硝噻吩染色，標準蛋白用考馬斯亮藍 R-250 染色，用 CurveExpert1.3 軟件計算 pIs 。
二、 結果
1． 接和試驗： 4 株臨床菌株結果均為陽性，其相應接合子分別為 C95 、 C96 、 C102 和 C106 。堿裂解法提取質粒，并用 TEM 引物進行 PCR 擴增，結果顯示：臨床菌株和相應接合子的質粒在 1009bp 處均可見到一電泳條帶，與標準菌株（ TEM-26 ）的擴增片段大小一致，而 C600PCR 擴增結果為陰性。表明這種 TEM 型 β內酰胺酶的基因位于質粒上。
2． 基因型鑒定：用 TEM 引物對 4 株臨床菌株進行 PCR 擴增，其結果均為陽性，其片段大小近 1009bp ，與標準菌株（ TEM-26 ）的擴增片段大小一致，而空白對照和 EcoATCC25922 的結果為陰性。這些片段經序列分析，結果顯示： 4 株細菌的序列均為 1009bp ，與廣譜酶 TEM-1 相比較，其序列有 6 個位點的改變，即第 124 位、第 8 位、第 48 位、第 134 位、第 160 位和第 242 位（ gga → ggg ），相應的氨基酸只有第 124 位的絲氨酸變為天冬酰胺。我們首次登錄 GenBank ，并被命名為 TEM-105 。
3． TEM-105 的特性研究：用 ESBLs 濃度梯度法進行鑒定，標準產 TEM-26 菌株的原核表達菌為陽性，而 4 株臨床菌株的 TEM 型基因的原核表達菌均為陰性，表明 TEM-105 為非 ESBLs 。等電聚焦電泳結果顯示該酶的 pI 為 5.4 。
三、 討論
本研究的，標準菌株（ TEM-26 ）經 TEM PCR 擴增后的目的片段，與 pET -28c 連接后，可成功地在 EcoDH 5a 感受態細胞中表達，這表明原核表達用于某種 β內酰胺酶的研究是可靠的。此外，質粒接合試驗證實了其耐藥基因位于質粒上。這表明，盡管由于點突變未引起β內酰胺酶活性部分的空間構象改變，所以未引起酶性質的改變。
通過對 KpnTEM 型 編碼基因的研究，在世界上首次報道了 TEM-105 ，并證明其為廣譜酶性質。