上樣
上樣也有干法和濕法之分：
干法（也稱硅膠制沙）就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。（我一般喜歡用這種方法，除非不能用）
濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。
濕法較方便，但不溶劑讓其完全被硅膠均勻吸附，不容易跑的很平整。
柱層析關鍵在于柱子是否裝好（這是最大影響因素）和淋洗劑是否選擇恰當。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點是：TLC（作用還是很大的）的作用除了跟蹤反應進程，檢測試劑和原料純度外，一個重要的用途就是為柱層析選擇適當的淋洗劑。
上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴散作用來分離，效果也不會好。（這一點很實用，不過有些特殊情況也不一定，如果要保險可以先做根小柱子跑一下，這樣最安全，就是花點時間）