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    發布時間:2020-09-07 11:53 原文鏈接: cDNA文庫組標準流程1

    一.Total RNA的提取

    (一) 試劑配制
    準備工作:
    1.研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部,置于烤箱內,180℃,烤6小時。
    2.50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡過夜后,121℃ 20mins 高壓滅菌。
    3.電泳槽及電泳托、梳子用3%雙氧水處理。
    4.常用試劑及其配方:
    ▲DEPC水:在1000ml去離子水中加入100ul DEPC, 靜置過夜后高壓滅菌。
    ▲0.78M檸檬酸納:PH=4~5
    三水合檸檬酸納 22.94g
    加DEPC水定容至100ml,室溫放置備用。
    ▲10%肌氨酸鈉:
    肌氨酸鈉 10g
    加DEPC水定容至100ml,室溫放置備用。
    ▲變性裂解液:
    0.78M檸檬酸鈉 8.25ml
    10%肌氨酸鈉 12.375ml
    異硫氰酸胍 118.05g
    加DEPC水定容至 250ml,室溫放置備用
    臨用前加β-巰基乙醇使其終濃度為1%(v/v)
    ▲ 2M 醋酸鈉 PH=4.5
    NaAc·3H2O 13.6g
    加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌,室溫放置備用
    ▲3M醋酸鈉 PH=5
    NaAc·3H2O 20.4g
    加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌,室溫放置備用
    ▲ 4M LiCL:
    LiCL 24.164g
    加DEPC水定容至100ml,高壓滅菌,室溫放置備用
    ▲0.5M EDTA PH=8.0
    EDTA 18.61g
    用NaOH調PH值至8.0,定容到100ml,高壓滅菌,室溫放置備用
    ▲10X MOPS (3-(N-嗎啉代)丙磺酸):
    MOPS 41.86g
    NaAC·3H2O 4.10g
    0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml
    用NaOH調PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室溫避光放置備用。
    ▲1x MOPS:
    10x MOPS 30ml
    加DEPC水270ml,用時現配。
    ▲4x RNA Loading buffer:
    10x MOPS 400ul
    甘油(高壓過) 200UL
    溴酚蘭 10ul
    甲醛 (37%) 72ul
    去離子甲酰氨 310ul
    EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul
    ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul
    在4℃ 可保持3個月
    ▲10x PBS
    pH=7.4
    NaCl 80g
    KCl 2g
    Na2HPO4 14.4g
    KH2PO4 2.4g
    定容至 1000ml

    ▲變性電泳膠:
    稱取0.5g瓊脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加熱至瓊脂糖熔化后,冷卻至50℃左右,加入2.5ml甲醛,輕輕混勻后倒入電泳托上。
    ▲變性電泳緩沖液:
    在250ml容量瓶內加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml


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