1、包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3、加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。
4、加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5、終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。