miRNA在性腺生殖細胞腫瘤中的研究進展

??生殖細胞腫瘤（germ cell tumor，GCT）是一類多見于年輕人群的腫瘤，常發生于性腺部位（包括男性睪丸和女性卵巢），也可發生于性腺外部位［1］。GCT的病理類型包括精原 細胞瘤、胚胎癌、未成熟畸胎瘤、卵黃囊瘤、非妊娠性絨毛膜癌、混合性GCT 等。睪丸GCT（TGCT）相對多見，而卵巢GCT（OGCT）則是一類相對少見的婦科腫瘤，約占卵巢惡性腫瘤的5％，見于年輕女性及幼少女［2］。目 前，臨床廣泛應用的GCT 的腫瘤標志物包括AFP、β‐hCG、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等，但其敏感度僅約50％［3］。精原細胞瘤、未成熟畸胎瘤等缺乏特異的腫瘤標志物。近年來發現，微小 RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的發生、發展過程中出現異常表達，并可在腫瘤細胞的增殖、遷移等過程中發揮作用。本文就近年來miRNA在 性腺GCT中的異常表達和作用機制等方面的研究進展作一綜述。

一、miRNA的形成及功能

??miRNA 是一類小分子非編碼RNA（non‐coding RNA，ncRNA），由21~23個核糖核苷酸組成［4］。在細胞核中，其編碼基因在RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，POL‐Ⅱ）的作用下轉錄形成初級miRNA（pri‐miRNA），Ⅲ型核糖核酸酶Drosha 酶與RNA 結合蛋白DGCR8 形成的復合物使pri‐miRNA 形成發夾狀結構而成為前體miRNA（pre‐miRNA）。隨后，pre‐miRNA 進入細胞質，在Ⅲ型核糖核酸酶Dicer酶的作用下形成長約22個核苷酸的miRNA雙鏈體，再解鏈成為成熟miRNA［5］。成熟miRNA在細胞質中 與核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）等結合形成RNA誘導沉默復合物（RNA‐induced silencing complex，RISC）［6］，在轉錄后水平對基因表達進行負調控［7］。其調控有兩種模式，即靶向降解或抑制mRNA的翻譯過程，作用模式的選擇與 miRNA及其靶mRNA的互補程度相關，接近完全互補導致靶mRNA的切割降解，部分互補則導致mRNA的翻譯抑制［6］。miRNA在分泌到細胞外時 由于外泌體磷脂雙分子層的包裹而免受核糖核酸酶的降解作用，故在多種體液（如血清、血漿、尿液、精液、卵泡液等）中表現出較好的穩定性，容易取樣分析 ［8］。

二、miRNA在性腺GCT中的異常表達

??1.性腺GCT的起源與miRNA 表達：根據細胞起源、分化程度及發育潛力等不同，GCT可分為7種類型［1］，其中常見的是Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅱ型GCT起源于原始生殖細胞，包括精原細胞瘤和 非精原細胞瘤，其中精原細胞瘤包括睪丸中的精原細胞瘤、卵巢中的無性細胞瘤及性腺外的生殖細胞瘤，非精原細胞瘤包括胚胎癌、卵黃囊瘤、未成熟畸胎瘤和非妊 娠性絨毛膜癌；Ⅲ型GCT發生在性別分化后，起源于精原細胞，表現為精細胞腫瘤。Gillis 等［9］應用以實時定量PCR 為基礎的高通量篩選技術對156 種miRNA 在Ⅱ型和Ⅲ型GCT組織及細胞中的表達進行測定，發現精原細胞瘤和無性細胞瘤的miRNA表達特征基本相似，且與胚胎癌中miRNA的表達特征部分重合， 而精細胞腫瘤則呈現出完全不同的miRNA表達特征，與其起源及分化的類型相符合。

??2.miRNA在性腺GCT中的異常高表達：研究發現，無論年齡、病理類型及腫瘤部位，miR‐371‐3、miR‐302/367在GCT中均存在 異常高表達［9‐13］。Palmer 等［13］研究表明，miR‐371‐3、miR‐302/367 的升高與編碼基因轉錄的增加有關，腫瘤干細胞轉錄因子Nanog、TEA轉錄因子4（TEAD4）、八聚體結合轉錄因子3和4（Oct3/4）、轉錄因子 活化蛋白2C（TFAP2C）、SRY 相關轉錄因子（SOX）家族的SOX17、SOX15 在GCT 中高表達，其中SOX17、TEAD4 與miRNA 的表達水平呈正相關（P<0.05） ，Nanog、Oct3/4 在miR‐371‐373及miR‐302的編碼基因啟動子區域存在結合位點。信號通路異常激活和癌基因表達可能也對miR‐371‐3的表達起調控作 用。Zhou等［14］研究表明，在結腸癌細胞系Caco‐2、HCT15、RKO、SW480 和HCT116 細胞中，Wnt 信號通路激活后，β 連環蛋白（β‐catenin）進入細胞核內，與T淋巴細胞特異性轉錄因子（TCF）/淋巴樣增強結合因子1（LEF1）家族轉錄因子結合形成β‐ catenin‐LEF1復合物，隨后β‐catenin‐LEF1復合物特異性結合miRNA 編碼基因啟動子區域的3 個TCF/LEF1 結合元件（TCF/LEF1 binding elements，TBE），即TBE1、TBE3 和TBE4，從而誘導miR‐371‐3的表達。Cairo等［15］的研究則發現，在肝母細胞瘤中癌基因MYC對miR‐371‐3的表達呈現正調控作 用。

??3.miRNA 在性腺GCT 中的異常低表達：let‐7 家族miRNA 是一類調控細胞增殖的miRNA。Murray 等［16］研究表明，在惡性GCT中let‐7 miRNA的9個主要成員的表達水平均下降，以let‐7e最顯著。RNA結合蛋白LIN28通過結合let‐7 pre‐miRNA的終末環阻斷其成熟過程，從而降低成熟let‐7 miRNA的表達水平，而成熟let‐7 miRNA又可以負反饋抑制LIN28 的表達［17‐19］。此外，長鏈非編碼RNA（longnon‐coding RNA，lncRNA）對let‐7 miRNA的表達也有調控作用。Gao 等［20］的研究發現，在卵巢上皮性癌（卵巢癌）中，lncRNA人卵巢癌特異性轉錄本2（HOST2）通過抑制let‐7b miRNA 的表達從而促進腫瘤細胞的增殖和遷移。此外，Chang 等［10］對惡性OGCT 的miRNA 表達譜的分析表明，miR‐199a‐5p、miR‐202‐3p、miR‐214‐5p、miR‐513c‐5p 在惡性OGCT中的表達降低。

??4.miRNA 在不同病理類型性腺GCT 中的表達差異：Murray等［12］研究表明，無論是成人還是兒童，miR‐302/367在卵黃囊瘤中表達水平的升高較精原細胞瘤更顯著，可能與基因 轉錄增加有關。在卵黃囊瘤中高表達的10個轉錄因子中有9個與miR‐302/367的表達水平呈正相關，其中與鋅指蛋白轉錄因子（GATA）結合蛋白 6（GATA6）的相關性最強，GATA6、GATA3、轉錄因子7類似物2（TCF7L2）、肌腱膜纖維肉瘤轉錄因子（MAF）在miR‐ 302/367的上游存在結合位點，而其他轉錄因子則通過長距離增強子作用等調控miRNA 的表達。此外，miR‐122、miR‐205、miR‐200、miR‐375 在卵黃囊瘤中的表達水平也高于精原細胞瘤，miR‐29a‐b、miR‐96、miR‐142、miR‐146、miR‐182則在精原細胞瘤中呈現出更 高的表達水平［11‐12］。

??5.miRNA在鉑類耐藥的性腺GCT細胞中的異常表達：目前，GCT 的一線化療方案是博來霉素+依托泊苷+順鉑（BEP）方案。順鉑耐藥是性腺GCT治療的一大難題。Port等［21］研究發現，順鉑耐藥的GCT 細胞中miR‐371‐3 和miR‐520 的表達水平較順鉑敏感的GCT 細胞更高，而miR‐99a、miR‐100和miR‐145在順鉑耐藥的GCT 細胞中低表達。miR‐371‐3可通過降低大腫瘤抑制因子2（LATS2）的表達水平間接破壞p53信號通路，解除p53對細胞周期的阻滯作用，促進細 胞增殖和腫瘤發生［22］，miR‐520則通過抑制腫瘤抑制因子p21的表達參與其中［21］。

三、miRNA在性腺GCT中的作用機制

??1.細胞增殖及凋亡相關因子：miRNA對細胞周期蛋白的調控在腫瘤的發生、發展中起著重要作用。研究表明，miR‐372、miR‐373、 miR‐302a‐d 擁有共同的關鍵種子區域，長度為2~7個核苷酸分子（AAGUGC），可以與靶mRNA 的種子互補區（seed complementary region，SCR）六聚體（GCACTT）互補結合，這種六聚體在一些腫瘤相關的mRNA中富集，在GCT中呈低表達狀態［13］。 Voorhoeve等［22］研究發現，LATS2可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的作用從而使細胞周期停滯，miR‐372和miR‐373可 通過破壞RNA及抑制翻譯的聯合作用降低LATS2 的表達水平，影響p53信號通路，促進細胞增殖和腫瘤發生。Murray等［12］對卵黃囊瘤的研究顯示，與miR‐302互補結合的mRNA 在卵黃囊瘤中下調，其中包括細胞凋亡調控因子半胱天冬酶8（CASP8）、WD重復蛋白33（WDR33）、推定同源結構域轉錄因子2（PHTF2）以及 整聯蛋白B2（ITGB2）等。Das 等［23］則發現，在TGCT中抑制miR‐302的表達可顯著降低凋亡抑制蛋白survivin 的表達。同樣，在GCT 中表達下降的let‐7 家族miRNA，通過抑制細胞增殖調控相關蛋白的表達實現其對腫瘤的抑制作用，如MYCN、AURKB 等基因的mRNA 均是let‐7的靶標［16］。

??2.信號通路：Wnt信號通路與腫瘤發生的關系密切。在Wnt信號通路中，Wnt信號通路抑制因子Dickkopf 1（DKK1）、轉化生長因子β受體2（TGFBR2）、B淋巴細胞異位基因1表達蛋白（BTG1）以及左右決定因子1（LEFTY1）受miR‐ 372、miR‐373 的調控。miR‐372、miR‐373 的異常高表達可導致Wnt信號通路抑制因子DKK1 mRNA的表達水平降低，使腫瘤抑制因子TGFBR2 mRNA表達沉默，且BTG1蛋白表達下降，從而使Wnt信號通路維持激活狀態［14］。有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外信號調節激酶 （ERK）信號通路則可因miR‐302表達的升高促進ERK1/2的磷酸化而被激活［23］。Fustino等［11］發現，與精原細胞瘤相比，在卵黃 囊瘤中異常高表達的23種miRNA的靶標均可在骨形態發生蛋白（BMP）信號通路中富集，其中miR‐200可抑制BMP信號通路抑制因子Noggin 蛋白的表達，維持BMP信號通路的激活狀態。

??miRNA種類繁多，作用機制復雜，在不同細胞背景下相同的調控因子也可能表現出不同功能，其作用機制尚未完全明了，有待進一步探索。

四、miRNA在性腺GCT中的臨床應用展望

??現階段，miRNA 在性腺GCT 中的臨床研究大多以TGCT為對象。van Agthoven和Looijenga［24］的研究采用放大靶向血清miRNA 檢測方法（amplification targeted serum microRNA，ampTSmiR）檢測TGCT 患者及健康男性對照血清中miRNA 的表達水平，結果發現，TGCT 患者的血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p 和miR‐367‐3p 水平升高，對于TGCT 診斷的敏感度達90％。另有研究表明，血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p和miR‐367‐3p水平的異常升高在發現腫瘤殘留灶及預測復 發方面比現有的腫瘤標志物更加敏感［25‐26］ 。Le?o 等［27］ 研究表明，TGCT 患者的血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p和miR‐367‐3p水平可反映其臨床期別和治療效果；其中miR‐371a‐3p在GCT診 斷中的敏感度最高［28‐29］。Dieckmann等［28］的研究納入了616例TGCT患者和258例對照（包括睪丸良性疾病患者133例、健康男 性志愿者125例），結果顯示，血清miR‐371a‐3p水平診斷TGCT的敏感度為90.1％，特異度為94.0％，受試者工作特征曲線下面積 （AUC）為0.966，而AFP、β‐hCG和LDH 3種傳統腫瘤標志物聯合檢測診斷TGCT 的敏感度僅為50.0％；血清miR‐371a‐3p水平的升高程度與TGCT的臨床分期、腫瘤直徑相關，化療或手術治療后血清miR‐371a‐3p 水平下降明顯，因而在療效評估上有參考價值。Badia 等［30］的研究發現，血清miR‐371a‐3p水平對于預測TGCT患者殘留灶的特異度為100％，敏感度為93％。此外，miR‐371a‐3p對 預測疾病復發的敏感度也優于傳統腫瘤標志物檢測和影像學檢查［28，31‐32］。在預后分析方面，血清miR‐371a‐3p水平相對較低的患者預后較 好，治療前血清miR‐371a‐3p水平較低的患者其總生存時間和無進展生存時間均更長［33］。現已有2項前瞻性隨機臨床試驗將miR‐371‐3、 miR‐302/367在TGCT中的表達水平納入了研究中［34‐35］，分別是美國兒童腫瘤協作組（COG）發起的AGCT‐1531 研究和美國西南腫瘤協作組（SWOG）發起的SWOG‐S1823研究，若能在此類臨床試驗中證實miRNA可作為腫瘤標志物，即有望在未來進入臨床應用 之中。

??OGCT與TGCT在細胞起源、生物學行為及臨床診療方案方面都有共同之處，但目前miRNA在OGCT中的表達與應用仍在研究當中，暫無關于 miRNA在OGCT患者血清中異常表達的研究，這與OGCT病例數量較少、取材較困難等因素可能有關。隨著檢測技術的發展和對疾病認識的不斷深入，未來 miRNA可能成為OGCT研究的重要方向之一，在OGCT的臨床診斷、療效評估、隨訪監測等方面都將起到重要作用。

??總之，miRNA 的異常表達與性腺GCT的發生、發展密切相關。由于細胞起源以及分化程度不同，不同病理類型的GCT的miRNA表達特征不同。miRNA在GCT中的異 常表達與基因轉錄增加、信號通路激活以及癌基因的調控相關，同時miRNA通過對細胞增殖及凋亡因子、信號通路等的作用參與腫瘤細胞的增殖、遷移等過程的 調控。miR‐371‐3、miR‐302/367 在GCT 組織和患者血清樣本中均存在異常高表達，其中miR‐371a‐3p最突出，在GCT的診斷、療效評估、隨訪監測、預后分析中均優于傳統手段，有望成為新 型腫瘤標志物。在鉑類耐藥的GCT細胞中miRNA的異常表達也為疾病的分子診療和藥物研發提供了新的思路和方向。然而，現階段對于miRNA在GCT中 的研究多集中于TGCT，單獨針對OGCT中miRNA的研究不多，有待進一步探索。