寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA

實驗概要

本實驗介紹了寡聚(dT)-纖維素柱層析法純化mRNA。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A )的特點，在RNA流經寡聚(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚(dT)纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

實驗原理

真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構(m⁷G)和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly(A)尾，通常用Poly(A )表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。

主要試劑

1．3M醋酸鈉(pH 5.2)
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA(pH 8.0)；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育(30min)的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC

實驗步驟

1．將0.5-1.0g寡聚(dT)-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚(dT)-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H₂O洗柱。
3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．將RNA溶解于DEPC H₂O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。
5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD₂₆₀測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A )RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD₂₆₀測定Poly(A )RNA分布，合并含Poly(A )RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc(pH5.2)、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A )RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H₂O溶解RNA。

注意事項

1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。
2．步驟(4)中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級結構，使Poly(A )尾充分暴露，從而提高Poly(A )RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚(dT)-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH₂O、上樣緩沖液洗柱。
5．一般而言，10⁷哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A )RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。