張祺嶼等過氧化物酶建立標記闡明神經突觸連接模式

　　由于突觸連接的構成部分非常小（約數十納米），通常借助電子顯微鏡來闡釋神經元之間的突觸連接模式（synaptic connectivity）。現有的大規模神經系統電鏡重建數據（large-scale EM reconstruction of the nervous system）雖然可以用于構建無偏差的連接組，但是因為難以辨認神經元類群（neuronal population），導致這些數據通常不易解讀【1-3】。因此要同時得知突觸前神經元以及突觸后神經元的所屬群體通常需要多重標記（multiplexed labeling）。雖然電鏡有非常高的空間分辨率（spatial resolution），然而傳統的電鏡成像方法并不提供任何光譜分辨率（spectral resolution），導致通過基因編碼的（genetically encoded）多重標記仍然是困擾電鏡領域的一個問題。近年來多個課題組采用了不同的方法來嘗試解決這一個問題，但是這些方法都需要使用高度專業化的儀器設備【4-6】。因此開發一種通過基因編碼，兼容大部分已有的儀器設備，并且可以用于單切片（single section）以及立體重建（volume reconstruction）的電鏡多重標記方法，將會有助于了解神經突觸連接。

　　2019年3月19日，哈佛大學醫學院David D. Ginty研究團隊（張祺嶼為第一作者）在Nature Neuroscience發表了題為Multiplexed peroxidase-based electron microscopy labeling enables simultaneous visualization of multiple cell types的文章，報道了一種基于過氧化物酶、通過基因編碼的電鏡多重標記方法，并且展示了在小鼠的神經系統中如何使用這種方法來闡釋突觸連接模式。

　　該研究指出，傳統的電鏡成像方法雖然不能提供光譜分辨率，但是超高的空間分辨率使得分辨不同的細胞區室非常容易。因此如果使用過氧化物酶染色法在不同的神經元群體里標記不同的細胞區室，那么就可以在沒有光譜分辨率的情況下實現多重標記。研究者首先基于斯坦福大學Alice Y. Ting研究團隊開發的過氧化物酶APEX2【7】修改得到了二聚體dAPEX2，并展示了dAPEX2在表達于小鼠組織內時有更高的酶活性。研究者隨后將dAPEX2以及HRP（辣根過氧化物酶）和不同的靶向肽（target peptide）組合成不同的融合蛋白以標記不同的細胞區室，并展示了這種方法可以明確地標記五種不同的細胞區室：細胞質，內質網，線粒體基質，線粒體膜間隙，和突觸小泡（圖1）。

圖1 使用過氧化物酶標記的不同細胞區室。從左至右：（第一行）細胞質，內質網，線粒體基質，（第二行）線粒體膜間隙，突觸小泡

　　利用重組酶系統Cre和Flp，研究者使用表達這些融合蛋白的AAV（腺相關病毒）標記了小鼠神經系統不同區域的兩個或更多的神經元群體。研究者使用透射電鏡觀察這些組織的超薄切片，并確認了這些不同的標記可以被同時觀察到并明確區分開，而且可以觀察到這兩個或多個神經元群體之間的突觸連接（圖2）。研究者進一步展示了在電鏡圖像中這些不同的標記也可以被明確地區分并用于神經元重建。最后，研究者展示了將這些融合蛋白敲入小鼠中可以獲得可用的報告小鼠品系，進一步增強了這一方法的通用性。

圖2 二重（左圖及中圖）及三重（右圖）標記的神經組織切片

　　該研究提供了一種易于使用的通過基因編碼的電鏡多重標記方法，并展示了其在研究小鼠神經系統中的功用。由于與已有的儀器設備兼容，這種標記方法可以被以低廉的成本采用。研究者們希望這種方法可以幫助闡明已有的以及進行中的大規模電鏡神經系統重建數據。該研究中報告的AAV表達質粒可從Addgene獲取，報告小鼠品系則可從Jackson Laboratory獲取（詳情參見原文）。

　　據悉，哈佛大學醫學院David D. Ginty教授、David L. Paul教授為本文共同通訊作者。哈佛大學博士生張祺嶼為本文第一作者。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41593-019-0358-7

　　參考文獻

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　　6. Fang, T., et al. Nanobody immunostaining for correlated light and electron microscopy with preservation of ultrastructure. Nat Methods 15, 1029-1032 (2018).

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