Cell | 致癌病毒附加體維持的核心作用機制
EB病毒（Epstein-Barr virus）又被稱為人類皰疹病毒第四型，是一種具有致癌性的病毒，在增殖的宿主細胞中以多拷貝附加體（Episome）形式存在。EB病毒附加體的維持嚴格依賴于EBNA1，該因子是序列特異性DNA結合蛋白，但是一直以來對于該蛋白酶活性方面的研究還未見發掘。
近日，來自美國費城威斯達研究所的Paul M. Lieberman研究組在Cell雜志上發表了一篇題為Cell-cycle-dependent EBNA1-DNA crosslinking promotes replication termination at oriP and viral episome maintenance
的文章，揭示了EBNA1通過與DNA交聯促進在oriP位點的復制終止實現附加體維持的具體分子機制。
EB病毒長期潛伏感染，會增加癌癥和自身免疫疾病的風險【1-3】。EBNA1是潛伏感染期間病毒DNA復制和附加體維持所需的唯一病毒蛋白【4】。EBNA1是一個具有特定DNA具有高親和性結合的因子，但是一直以來領域內對于該蛋白的認識認為其缺乏固有的酶活性【5, 6】。EBNA1會結合在病毒質粒復制起始點的重復DNA識別元件oriP位置處，其中包含一個FR（Family of repeats）重復序列以及一個DS（Dyad symmetry element）對稱元件。oriP也是復制分叉終止并形成重組結構的區域【7】。但是目前為止對于EB病毒DNA在oriP位置復制叉阻遏并終止的具體機制還不得而知。
為了揭開這一問題的答案，作者們首先利用RADAR（Rapid approach to DNA adduct recovery）技術對EBNA1與DNA的共價交聯進行檢測，該技術先前已經被用于例如拓撲異構酶與DNA交聯的檢測【8】。作者們發現，利用RADAR技術可以檢測到EBNA1與DNA形成加合物（圖1）并且發現該加合物的形成是細胞周期依賴的。
為了對EBNA1中參與DNA交聯的原理進行解析，作者們檢測了EBNA1的蛋白質與DNA結合的 2.7 埃分辨率的晶體結構。通過引入不同突變并結合RADAR技術對與DNA交聯能力的檢測，作者們發現EBNA1中Y518位點突變導致EBNA1-DNA加合物形成的能力顯著降低。作者們想知道DNA交聯加合物形成能力的降低是否是由于該位點的突變影響了EBNA1與DNA結合的能力。為此，作者們通過ChIP實驗對野生型的EBNA1與Y518突變型的EBNA1結合DNA的能力進行檢測后發現，Y518F突變型的EBNA1可以結合oriP
DNA且結合能力與野生型類似，但是不能在蛋白未變性的天然構象下形成共價的DNA加合物。另外，通過進一步對Y518F突變體對病毒功能性的影響進行評估，作者們發現Y518F的突變會顯著降低病毒oriP質粒的維持以及DNA復制
為了揭開Y518位點對于附加體維持的具體機制，作者們進行了對活細胞中DNA復制和重組結構進行了2D中性瓊脂糖凝膠分析。通過該實驗，作者們發現Y518位點對于在oriP位點高效的復制叉暫停是必須的，而且這些活性與EBNA1-DNA交聯以及附加體功能維持相關。另外，作者們想知道EBNA1與DNA磷酸骨架交聯是否與核酸內切酶活性相關，作者們對EBNA1與oriP中FR重復序列或者是4WJ（4-way Holliday junction）的復合物進行了純化。作者們發現野生型的EBNA1會在DNA底物上在特定位點產生強力的切口，而在Y518突變體的純化復合物中則并未發現相同的切割位點。該結果證明了EBNA1 Y518位點對于DNA核酸內切酶活性非常關鍵。
總的來說，該工作發現EB病毒中DNA結合蛋白EBNA1對于附加體的維持以及致癌性非常關鍵，EBNA1會與oriP
DNA形成細胞周期依賴的共價DNA交聯加合物，而其中的具體機制則是因為EBNA1中包含關鍵的、進化上保守的Y518位點，該位點的突變會破壞DNA交聯以及EB病毒附加體的維持，而EBNA1實現該功能主要是由于該DNA結合蛋白具有位點特異性的核酸內切酶活性，該酶活性對于DNA復制叉在oriP位點的終止非常關鍵。因此，該工作為EBNA1作為藥物開發靶點提供了重要的研究依據。