蛋白純化經驗指南3
56) 向您請教一個問題，我用pET28載體、宿主菌BL21(DE3)表達目的蛋白，目的蛋白的兩端都帶His-tag,蛋白的大小為37kD，在利用Ni-NTA純化時總是在目的蛋白帶旁邊伴隨一條帶去除不了，請問有什么高招可以解決這個問題？!!!此外，該表達產物為包涵體，請問這種產物可不可以直接用來制備抗體？謝謝！！！ 也許這兩個都是你要的目標蛋白呢,會不會是這樣呢,你可以用his的抗體做WB看看是不是這樣的,如果是,那說明是這樣的情況.此外你可以再平衡緩沖液中加0.5%的吐溫等表面活性劑,這樣可以去除一些非特異吸附,此外你可以用pH45左右的變性溶液去洗,這樣也能去掉一些雜質,最后在用咪唑溶液洗脫.如果你這樣都去不掉,而做WB也有兩條帶,那說明可能是降解,超聲破碎的時候功率別太大,時間也別太長,注意溫度,因為超聲有時候也可能會使蛋白降解. 57) 我做得GST融合純化，目的蛋白在66KD附近，但每次純化出來的總......閱讀全文
蛋白純化經驗指南3
56) 向您請教一個問題，我用pET28載體、宿主菌BL21(DE3)表達目的蛋白，目的蛋白的兩端都帶His-tag,蛋白的大小為37kD，在利用Ni-NTA純化時總是在目的蛋白帶旁邊伴隨一條帶去除不了，請問有什么高招可以解決這個問題？!!!此外，該表達產物為包涵體，請問這種產物可不可以直接用來制備
蛋白純化經驗指南1
蛋白純化經驗指南生物谷整理?http://www.bioon.com??原創：Chromatography weixingui@263.net，?推薦書籍：《蛋白純化與實驗鑒定指南》、《生物工程下游技術》、《酶工程》、《酶制劑工業》?1) 我現在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親
蛋白純化經驗指南4
86) 選擇sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的處理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,內徑為1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不會有問題.?1,我們實驗室沒有sephadex G75(3000-80000)，最接
蛋白純化經驗指南2
28) 首先我想問一下agarose和sepharose區別,我的理解是:都指瓊脂糖,但agarose是未連接其他介質的,而sepharose是連接其他介質的,不知理解對不對?請指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutath
Amicon?－Pro蛋白純化濃縮操作指南
蛋白從克隆表達到純化脫鹽濃縮，一路經過千山萬水，寶貴的活性蛋白產量是很多人的“命根子”。然鵝，努力的我們還是苦惱的時候多，欣喜的時候太少太少～～??純化黑科技，是時候放大招了?有沒有什么好方法能讓操作步驟少一點、再少一點，而同時蛋白的活性及產量損失也少一點、再少一點？？?讓我們看看那些蛋白操作高手的
RNA抽提注意事項和經驗指南3
RNA 抽提的“三大紀律八項注意” 紀律一：杜絕外源酶的污染。注意一：嚴格戴好口罩，手套。注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。紀律二：阻止內源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意
基因cloning經驗指南
我們克隆基因的時候，往往可以通過一些途徑（如pcr,EST庫或者文庫篩選）得到基因的部分片段。然后通過3'race 和 5'race 方法往兩端延伸。有時會出現無法延伸的狀況，如果你超作沒有失誤的話，這時候很有可能是你模板GC含量過高的緣故，普通pcr 是沒有辦法延伸的，可以用擴高g
蛋白質提取與純化技術3
1、減壓加溫蒸發濃縮 通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。 2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室，用電扇對準吹風
蛋白質純化(protein－purification)實用技術3
10．非極性基團之間作用力溶質分子中的非極性基團與非極性固定相間的相互作用力（非選擇性分散力或倫敦力）大小與溶質分子極性基團與流動力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進行分離。因其流動相中的置換劑是極性小于水的有機溶劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃等），這些有機溶劑可能使許多蛋白質分子產生不可逆的變
溶菌酶分離純化及酶活力、蛋白濃度測定3
同時，為了監測分離純化的效果，我們必須對相應的結果進行檢測。對于酶而言，主要通過其催化特異的反應進行監測。溶菌酶對革蘭氏陽性菌的細胞壁有明顯的破壞作用，可利用這一特性進行溶菌酶活性的監測，以便我們區分在純化過程中，含有溶菌酶的組分。類似的采用 DEAE- 纖維素對抗體進行精制，特別是經過初步純化后的
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（三）
蛋白質純化RP-HPLC 是一種有效的蛋白質/多肽純化工具。通過 RP-HPLC 法可以從雜質中分離目標蛋白/多肽，采集到的片段可用于進一步研究，以及借助正交分析技術的分析，甚至可作為治療藥物。在蛋白質/多肽分析過程中，色譜條件優化的目標是優化分辨率和保留時間。制備色譜法分離蛋白質/多肽時，色譜條件
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（四）
柱內徑由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內徑小于2mm）。小規模實驗室純化采用細孔柱（內徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內徑）。這種小規模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。需要大量蛋白質/多肽時，采用10mm和22mm內徑的柱子。1 mg蛋白質或多肽的純化可采用10 mm柱子
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十五）
其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑。 如圖18所示，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM，pH為2~2.5。此外，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質的分離效果要優于TFA。
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（九）
胰蛋白酶水解分析。蛋白質水解產生的肽段利用反相高效液相色譜分析，流動相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導致較早洗脫出肽的色譜的不可重現性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。梯度洗脫的時間取決于待水解蛋白的大小。大分子蛋白比小分子蛋
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十二）
蛋白質/多肽液相分析中的流動相選擇有機溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當有機溶劑量達到針對每一蛋白質的特定濃度時，蛋白質就會從疏水界面上解吸，繼續順著柱向下，從而從柱中洗脫。圖14. 當有機改性劑的濃度達到特定值時，蛋白質從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時最常
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（七）
在氧化環境條件下，盡管蛋白質的幾個氨基酸都可能受影響，但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）。對甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質中的位置。埋藏在蛋白質內部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側鏈最有可能被氧化。氧化條件包括熱、過渡金屬的存在以
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（五）
二硫鍵測定蛋白質依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級結構和生物活性。如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質會失去天然三級結構和生物活性。HPLC保留值取決于蛋白質“疏水腳”的大小（圖41），它會受到三級結構的影響。二硫鍵的改變通常會使“疏水腳”增大，從而使蛋白質在反相HPLC中的保留值增大。圖42中，天然白細胞
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（六）
蛋白質在高溫或高pH值下會降解。在脅迫條件下，最有可能發生的化學降解是酰胺側鏈上的天冬酰胺轉變為天冬氨酸或異天冬氨酸（圖37)。天冬酰胺脫去酰氨基時，許多蛋白都會失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。特定天冬酰胺殘基
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（八）
肽圖分析法 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南反相高效液相色譜已成為蛋白質分析和表征的標準方法，尤其是治療性藥物的分析和表征。反相色譜分析法分辨率高，檢測靈敏度好，能夠提供大量關于蛋白質的信息。有些時候，蛋白質作為完整的分子分析，但更多的時候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十六）
選擇合適的色譜柱微粒。通過與柱內填充微粒疏水表面的相互作用實現蛋白質與多肽的分離。柱內填充粒通常以硅膠為基礎，這是因為硅膠的穩定性高，能夠在大多數溶劑條件下（除了pH大于6.5的情況）保持穩定，此外，硅膠可以形成各種大小的具有不同直徑的多孔球形顆粒。硅膠純度。高效液相色譜柱所用硅膠填料的純度對分離性
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十一）
HPLC-MS 聯用的兩個重要因素是電噴射接口的最佳流速及三氟乙酸對肽電離的影響 基本電噴霧接口的信號在5~10μL/min的流速區間上迅速下降（圖28）。這與采用標準分析型HPLC柱的流速不相容。目前，商用電噴霧提供一種高剪切流氮氣輔助的電噴霧（氣流輔助電噴霧），它將電噴霧的最佳流速區間提升到了2
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十三）
?圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響 洗脫液：加入如圖所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為15分鐘。樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（H
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十七）
選擇分離表面。硅膠表面改性所用的化學過程允許多種有機基團附著在硅膠表面。最常見的改性是鍵合一條十八碳線性脂肪鏈，形成“C18”柱或ODS柱（圖10A）。如圖所示，有機氯硅烷與大多數硅烷醇基反應，但仍有部分不反應，這會在硅膠表面形成一層較厚的碳氫化合物層。蛋白質和多肽可以吸附到該碳氫化合物層。C18柱
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（一）
蛋白質組學蛋白質組學是鑒定和定量細胞、組織或生物體蛋白質的科學，目的是了解生物學變化和疾病狀態，開發疾病的生物標記和治療藥物的靶點。如果將一個基礎蛋白的各個修飾蛋白算作一個蛋白，那么哺乳動物細胞含多達3~4萬個蛋白。當計算各個修飾后的蛋白時，蛋白質的數量遠遠超過了10萬。細胞內不同蛋白質的豐度或濃度
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十四）
蛋白質/多肽液相分析中的流動相選擇有機溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當有機溶劑量達到針對每一蛋白質的特定濃度時，蛋白質就會從疏水界面上解吸，繼續順著柱向下，從而從柱中洗脫。 圖14. 當有機改性劑的濃度達到特定值時，蛋白質從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時最
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十）
反相高效液相色譜和質譜（MS）的聯用為蛋白質/多肽分析提供了強大的工具。20世紀80年代，約翰·貝內特·芬恩和他的同事們開發了電噴霧離子源，使質譜與反相高效液相色譜得以聯用。采用液相色譜-質譜聯用的好處包括：質譜是非常靈敏的檢測技術。 質譜可以提供所分離多肽/蛋白質的分子量。 質譜可利用分子
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十八）
引言反相HPLC已成為分離和分析蛋白質和多肽的重要工具。它在生物技術行業中被廣泛應用于蛋白質類治療產品的表征，以及這些產品和雜質的鑒定。在通過質譜鑒定蛋白質之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質組中分離多肽方面有著至關重要的作用。它也被用于探索性研究中多種蛋白質和多肽的純化，以及蛋白類治療藥物的大規模
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（二）
色譜分析色譜技術已發展成一種強大的分離技術，能夠分離大量蛋白質和多肽。但任何一種單獨的色譜技術仍然只能分離出一小段蛋白質。因此，多種色譜技術的結合使用已成為蛋白質組分析中蛋白質分離的一種普遍方法。二維色譜在長期的蛋白質純化模式的基礎上，John Yates和同事開發了一種名為多維蛋白質鑒定技術（Mu
核酸分離純化實驗技術指南
?核酸分離純化實驗技術指南：? ? ? 總RNA提取常見問題分析? ? ? RNA降解? ? ? 1. 新鮮細胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如? 果將裂解液直接加入培養皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。?? ? ? 2. 新鮮組織：某些富含
病毒純化和蛋白純化區別
病毒純化和蛋白質純化都是生物制劑工程中常見的分離純化方法，但它們的對象不同，具體區別如下：1. 病毒純化與蛋白質純化對象不同。病毒純化的目標是將病毒從其它生物物質中進行分離和去除，以獲得單個且純凈的病毒顆粒，如用于疫苗生產的病毒載體，而蛋白質純化的目標是從生物體或來源中提取和純化單一或多種蛋白質，如